SARS_COV_2 Spekülasyonları

Korona virüs pandemisi Dünya’nın tüm ülkelerini ciddi oranda etkileyen son yüzyılın en etkili pandemisi olarak nitelendirilmektedir. Tüm ülkeler virüsle mücadele için aşı ve ilaç çalışmalarına devam etmektedir. Dünya virüs ile mücadele halindeyken, bir çok spekülatif haberde toplumda yayılmakta ve süreci yakından takip edemeyen insanları şüpheye düşürmektedir. Bu spekülatif haberlerin başında virüsün hala izole edilemediği ile ilgili yalan haberler gelmektedir. Bu iddiaların temeli ABD’li Andrew Kaufman, Thomas Cowan ve Sally Fallon Morell gibi isimlerden oluşan birkaç doktorun hazırladığı “Virüs İzolasyonu Bildirgesi”’ne dayanmaktadır. Ancak bu bildirgeyi hazırlayan bilim insanlarından hiç birinin virolog, mikrobiyolog ya da epidemiyolog olmadığı görülmektedir.

SARS-COV-2 virüsü birçok defa laboratuvar ortamında izole edilmiştir. İlk defa 7 Ocak 2020 tarihinde Çin’de Wuhan Viroloji Enstitüsünde izole edilen virüsün RNA olan genetik materyali dizilenmiştir. Ardından; ABD, Güney Kore, Kanada, Güney Afrika, İtalya ve Türkiye virüsü izole ettiklerini açıklamışlardır. Türkiye’de virüs ilk olarak Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsünden Prof. Dr. Aykut Özkul ve ekibi tarafından sonra da Halk Sağlığı Genel Müdürlüğü, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarı ve Biyolojik Ürünler Dairesi Başkanlığı tarafından izole edilmiştir.

Virüsün Elektron Mikroskopisi ve Kriyo-Elektron Tomografisi Tekniği ile elde edilen görüntüleri de Science ve Nature gibi dergilerde yayınlanmıştır (Zhou vd. 2020; Turoňová vd. 2020). Böylelikle virüsün izole edilemediği ile ilgili haberlerin asılsız olduğu kanıtlanmıştır. Ancak temel bilimlerin anlaşılamamasından kaynaklanan sebeplerden dolayı spekülatif haberler her geçen gün artmaya devam etmektedir. Bundan sonraki süreçte, toplumda oluşan yanlış bir başka iddia ise virüsün PZR gibi yöntemlerle tespit edilemeyeceği yönündedir. Bu asılsız iddiayı çürütmeden önce çok genel hatlarıyla, polimeraz zincir reaksiyonu tekniklerinden biraz bahsedelim;

Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR veya PCR); DNA ve RNA dizilerini çoğaltmak ve belirlemek için kullanılan, yaygın bir moleküler biyoloji tekniğidir. PZR tekniğinin çalışma mekanizması oldukça basittir. Öncelikle, çift iplikli (dsDNA) DNA’nın denatüre edilerek tek iplikçik haline gelmesi sağlanır. Ardından çoğaltılacak bölgenin primerleri, DNA ipliklerine bağlanır ve primerler DNA polimeraz enzimi tarafından uzatılır. Uzama işlemi çalışmanın amacına göre 20 ile 40 defa tekrarlanabilir. Klasik PZR işlemi amplifiye olan genetik materyalin, reaksiyon bittikten sonra da kullanılabilmesini sağlar. qPZR kantitatif (nicel) PZR olarak tanımlanan nükleik asitlerin belirlenmesinde, karakterizasyonunda ve miktar tayininde kullanılabilir. Klasik PZR yönteminden farklı olarak floresan işaretlemeyi sağlayan boyalar veya problar kullanılır. Her döngüde ölçülen floresan ışıması ile reaksiyon sırasında kopyalanan DNA miktarı gerçek zamanlı olarak ölçülebilir. Prob tabanlı qPZR’da ise her numunede aynı anda birçok hedef tespit edilebilir. Ancak bu durum primere ilave olarak, hedefe özel probların tasarımını gerektirir. Birkaç tip prob tasarımı mevcuttur, ancak en yaygın tip, bir florofor ve söndürücü kullanımını içeren bir hidroliz probudur. Floresan rezonans enerji transferi (FRET), prob sağlam iken floroforun söndürücü aracılığıyla ışığın emisyonunu önler. Bununla birlikte, PZR reaksiyonu sırasında, prob bağlı olduğu spesifik dizinin primer uzatılması ve amplifikasyonu sırasında hidrolize edilir. Probun hidrolizi, floroforu söndürücüden ayırır ve floresanda amplifikasyona bağlı bir artışla sonuçlanır. Böylece, prob tabanlı bir qPCR reaksiyonundan gelen floresan sinyali, numunede bulunan prob hedef dizisinin miktarı ile orantılıdır. Prob bazlı qPCR, boya bazlı qPCR'den daha spesifik olduğundan, genellikle qPCR tanı testlerinde kullanılmaktadır.

Bugün birçok ülkede SARS-COV-2 tanısında kullanılan qPZR kitleri prob temelli kitlerdir. Tasarlayıcının insiyatifine ve mali alt yapısına göre birden fazla prob kullanılabilir. Örnek vermek gerekirse, 2020 Mart ayından Çin’den gelen COYOTE marka tanı kitlerinde 3 floresan problu bir yöntem uygulanmıştır. Kitte; virüsün korunmuş ORF1ab ve N genini ve internal kontrol için RNase I’i saptamak amacıyla spesifik primerler ve floresan etiketli problar kullanılmıştır. Virüsun ORF1ab geni için, oligonükleotidin terminal uçlarında FAM detektörü ve BHQ söndürücüsü etiketlenmiştir. ROX ise N geni için bir dedektör olarak etiketlenmiştir. Reaksiyon esnasında, hedef sekans amplifiye olmakta ve floresan işaretli prob, mix içeriğinde bulunan Taq DNA polimeraz enziminin ekzonükleaz aktivitesi sayesinde degrade olarak floresan sinyalinde bir artış meydana getirmektedir. Kit içeriğinde bulunan HEX işaretli prob da insan RNaseI genini belirleyerek reaksiyonun kontrolünü sağlamak amacıyla kullanılmaktadır. Dolayısıyla, pozitif bir bireyden alınan numune değerlendirilirken ekranda, FAM, ROX ve HEX ışımasının görülmesi beklenir.

PZR, qPZR ve qRT-PZR spesifik çalışmalara olanak veren ve oldukça güvenilir moleküler biyoloji teknikleridir. Olası bir tanıda tercih edilmesinin sebebi tekniğin güvenilirliğinden kaynaklanmaktadır. SARS-COV-2 kitlerinde kullanılan ORF1ab gen bölgesi evrimsel açıdan korunmuş bir gen bölgesi olduğundan dolayı, mutasyona uğrama ihtimali düşüktür. Bu nedenle, o bölgeye özgü primerler ile kolaylıkla belirlenebilir. Bu nedenle virüsün qRT-PZR tekniği ile belirlenemeyeceği ile ilgili haberlerin asılsız olduğu aşikardır.

Kaynaklar:

Zhou, P., Yang, X. L., Wang, X. G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., ... & Shi, Z. L. (2020). A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. nature, 579(7798), 270-273.

Turoňová, B., Sikora, M., Schürmann, C., Hagen, W. J., Welsch, S., Blanc, F. E., ... & Beck, M. (2020). In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science, 370(6513), 203-208.